通常来说，真核生物的基因，这里主要指的是植物gene的克隆，常以cDNA为模板进行克隆。这就有个问题，很多同学想要的基因尝试克隆了N多次都拿不到，这就很恼火，连基因都拿不到，还搞什么？

问题的关键应该首先考虑cDNA。

只要cDNA没有问题，那理论上肯定可以克隆到想要的基因。这就不得不考虑RNA的质量以及反转录质量。只有谨慎操作，从源头避免问题，才能在后续实验中规避掉尽可能多的意外bug

RNA提取的注意事项RNA的质量几乎决定了后续实验的成败。常见的挑战有：RNA降解、低纯度、低产率及DNA污染等。1采样后立即稳定RNARNA不稳定，极易降解。许多样品含有高水平的RNase，会快速降解RNA。为保证RNA 的稳定，应在采样后立即置于液氮，并尽快提取RNA。2确保样品充分溶解这是提高RNA产量和质量的重要一环。3消除DNA污染注意：目前RNA的提取已十分便捷，只需按照试剂盒操作步骤严格执行，基本上不会出现大的问题。反转录原理（上）真核生物mRNA结构的 特征是5‘端的帽子结构及3’端的多（A)结构。也正因如此，常用oligodT片段与mRNA上的多（A)相配对，作为反转录的引物，可由此获得mRNA的全长。（中）此外，针对真核生物mRNA的反转录，还可采用基因特异性引物，仅扩增需要的cDNA。该引物在后续还可以作为PCR的反向引物。（下）随机引物。检查RNA的完整性RNA的质量直接影响了cDNA的质量。而不用时间节点采样，提取的RNA质量也会有差异，因此有必要在RNA提取后检查RNA的质量及完整性。通常完整的真核生物RNA包括28S和18SRNA条带，两条带的亮度应差不多。基因的克隆

即使十分小心的提取了RNA，又十分谨慎的进行了反转录拿到了cDNA，有时还是无法得到自己想要的DNA，一遍一遍又一遍……这时或许可以从以下几个方便考虑：1使用多个不同批次的cDNA模板分别克隆；2将多个批次的cDNA模板混匀后进行克隆；3如果以上两种方法均未果，可针对目的基因设计基因特异性引物，获取目基因cDNA后再克隆（小概率事件，但我觉得有必要尝试。因为真核生物mRNA几乎无一例外都有多（A）尾巴）；4如果以上三种方法都未果，那就有可能是个假基因，或许有必要从基因本身的结构考虑。

学术交流QQ群由于有很多读者经常向我提出很多问题，有关乎实验的，也有生信相关的一些小问题，但随着问题的不断增多，我确实没有精力一一回复，主要是很多问题会被重复问及。因此，本着开放、交流的原则，依托此


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